DECODE project 研究テーマ

細胞ライブイメージングと1細胞RNAシークエンシングの融合

概要

近年、次世代シークエンサーによるRNAシークエンシング技術が発展し、1細胞内の全遺伝子発現を網羅的に解析できるようになりました。しかし、細胞内の全遺伝子発現を調べるには、基本的にその細胞を破壊しないといけません。もし顕微鏡で細胞を観察しただけで、その細胞内の全遺伝子発現が予測できるようになれば、生きたままの状態で細胞の詳細な内部状態をとらえることができます。我々は機械学習を用い、大量の1細胞顕微鏡画像と1細胞全遺伝子発現データを結び付けることにより、細胞を観ただけでその細胞内の全遺伝子発現を予測することを目指します。

イメージング、シークエンス、機械学習

クリックすると拡大します


細胞内微細構造の3次元超解像ライブイメージング

概要

独自に開発した「高速超解像顕微鏡」を用いて、世界最高のシャッター速度で、生きた細胞内の微細構造を観察します。ミトコンドリアなど細胞内小器官の形態と動態、核内微細構造の詳細な観察により、細胞の状態を活きたまま非侵襲でDECODEします。

超解像顕微鏡で撮影したミトコンドリア外膜

ミトコンドリア外膜

小胞体の3次元超解像ライブイメージング画像

小胞体の3次元超解像ライブイメージング画像

ラマン散乱スペクトル―RNA シーケンスデータ対の収集

概要

私たちは、細胞から発せられるラマン散乱光から遺伝子発現を予測する技術を確立し、この『散乱光から細胞内部を予測/推定する』コンセプトを実証することを目指しています。散乱光のひとつであるラマン散乱光のスペクトル形状は、物質内部の全ての分子振動モード(CC、SH、ベンゼン環等)により決定されます。細胞は大小種類を問わず様々な分子種から構成されているため、細胞から発せられるラマン散乱光のスペクトルは、分解分析することは出来ないほどに複雑になります。しかし、どれだけ複雑であっても、細胞内で遺伝子発現が変化すれば、構成分子の種類や比率も変化し、それに伴いラマン散乱スペクトルも変化します。つまり、計測されるラマン散乱スペクトルは「細胞の機能/状態」を介して遺伝子発現パターンと間接的であるが確実に相関関係があるはずです。複雑に修飾された散乱光(非侵襲で計測できる ラマン散乱光)から、観察試料の内部状態(侵襲的にしか計測できない遺伝子発現)を予測/推定できる可能性があるのです。
上述のコンセプトを実証するため、10種類の薬剤耐性菌のラマン散乱スペクトルとRNAシーケンスデータのペアを収集し、これら二つの異なるデータペアをつなぐための機械学習モデルを構築しました。この機械学習モデルにより80~90%の精度で、ラマン散乱スペクトルから薬剤耐性大腸菌の遺伝子発現パターンを推測することに成功しています。さらに私たちは、哺乳類細胞においても同じコンセプトが成立することを実証するために、疾患由来人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いた同実験を行うと共に、単細胞におけるラマン散乱スペクトル―RNA シーケンスデータ対の自動収集を可能とする顕微鏡システムの構築を行っています。

散乱光から細胞内部を予測/推定する模式図

クリックすると拡大します


超画像イメージングと機械学習を併用したアクトミオシンの構造解析による発生過程における毛細血管内皮細胞の力学的状態の解明

概要

組織に栄養を供給し老廃物を運び出す毛細血管は、既存の血管から内皮細胞が移動、出芽した後に血流にさらされる発芽性血管新生によって作られる。機械学習によるラベリングを行ったゼブラフィッシュの胚では、血液による灌流の開始直後に毛細血管内皮細胞は活発に遊走を始めた。更にスピニングディスク超画像顕微鏡で観察したところ、細胞一つ一つのアクトミオシンネットワークは様々であり、それぞれが異なった力学的状態にあることが示唆された。興味深い事にその翌日、内皮細胞の運動性は大幅に低下しアクトミオシンネットワークの多様性も見られなくなった。内皮細胞と毛細血管が、より安定した状態に移行した事を示している。私達は、毛細血管安定化のメカニズムを解明する為、様々なアクトミオシンの構造と内皮細胞の状態(遊走、伸長、収縮、静止)の関連性を調べている。この研究により、in vivoでの毛細血管の形成過程を未だかつてない解像度で明らかにし、組織血管化の全く新しいメカニズムを示すことが可能となる。


生きた卵母細胞・受精卵における染色体同定技術の開発

概要

細胞には、サイズや遺伝子密度の異なる複数の染色体が存在し、細胞分裂によって均等に分配されていく。卵母細胞や受精卵では、老化に伴って特定の染色体で分配異常が起こることが知られている。これまで個々の染色体の動的な挙動を解析できるツールはなく、なぜ特定の染色体で分配異常が起こるのかは不明である。そこで、本研究では、生きたマウス卵母細胞や受精卵における個々の染色体を同定可能な解析ツールを作製し、4Dイメージングによる分配異常メカニズムの解明を行う。不活型Cas9と複数種の蛍光タンパク質によって、全ての染色体に蛍光タンパク質による“模様”を施し、その模様をもとに全20種(1-19番、X)存在する染色体を同時に同定し、その動的挙動を解析していく。


NMRを用いた多様な細胞の状態を見極める観測法の開発

概要

細胞は増殖・分化の過程、周囲の環境変化に適したさまざまな状態をとります。このような細胞の多様な状態の違いを見た目の変化だけではなく数値の違いとしても検出できれば、細胞周期や環境適応の詳細な理解や、特定の臓器への分化条件の最適化などに多いに役立ちます。
NMR法は原子核が本来持つ磁気的な性質を観測することで、細胞に負荷をかけることなく、分子の違いやその量の違いを検出できます。さらに、われわれがもつ独自の細胞包埋技術を組合わせることで、細胞を生きた状態で長時間観測することが可能です。
細胞は状態毎にさまざまな異なった分子を合成・分解・取込・排出するため、NMRによる分子の検出と、データサイエンスの手法とを組み合わせることで、細胞の状態を経時的・定量的に見極める手法の開発に取り組んでいます。


人工MET発生系と機械学習を組み合わせた細胞特異性の同定と解析

概要

腎臓発生の過程で、腎臓前駆細胞である腎間葉系前駆細胞は、間葉上皮転換(MET)をすることで腎胞となり最終的にネフロンという腎臓の機能を担う上皮構造へと発達する。我々はこれまでの研究で、ヒトiPS細胞から誘導した腎間葉系前駆細胞にカノニカルWnt刺激を与えることで、in vitroでMETを起こす系を作成した。そして、この腎間葉系前駆細胞のMETは、一定であるが、とても低い確率でしか発生しない。一見均一な細胞から構成される集団内部で、低い確率でしかMETイベントが発生しないのはなぜなのか。
本研究計画では、「METイベントの人工発生系」を用いて、in vitroにおいて腎臓前駆細胞の上皮化が一定確率で発生する原因となる細胞特異性を明らかにする。具体的には、「METイベントが発生する予定細胞」を仮定し、これを同定する。そのために、METイベントのリアルタイムモニタリングの系を構築した上で、機械学習系を用いて、METが発生する直前の細胞をprospectiveに検出し、その特徴を解析する。
本研究により、ヒト腎臓におけるネフロン数が決定される機構の解明に迫ると共に、その知見は将来的に、腎臓組織を人工的に効率的に誘導する新たな手法の開発にも応用利用できる。

腎臓オルガノイドの写真とその発生原理の探索過程の図

クリックすると拡大します


機械学習による複雑脳幹細胞細胞系譜のパターン検出

概要

霊長類や食肉類などのシワのある脳(複雑脳と呼ぶ)の細胞系譜は類型的なマウス神経幹細胞系譜とは対照的に多様性に富み、それが脳の巨大化と局所回路の多様性の一因となっている。多数の幹細胞系譜(できれば幹細胞当たりの全系譜)を決定することから、不均一性に隠された特徴的パターン抽出する。


ナノ流体チップ -マイクロからナノへ-

概要

当チームでは、高速・高解像での細胞分析が可能なマイクロデバイスの開発において世界をリードする技術・実績を有し、バイオ研究に展開してきた。BDR内においても、各チームやプロジェクトに細胞や組織の解析等のためのマイクロデバイスを作製・供与してきた。近年ではこのコンセプトを分子、すなわちナノスケールに展開し、BDRが得意とする分子の計測・計算・解析の技術と融合し、新たな研究領域を切り拓こうとしている。
ただし、ナノスケールは単に作製が困難なだけでなく、水やものを流すのも困難であり、分子とバルクの境界領域にあるため、水やその他分子の振る舞いがバルクと異なることも示唆されており、エンジニアリングだけでなくサイエンスの意味合いも強い前人未到の開拓困難な領域であるが、それゆえに世界の他の研究所等ではできず、きわめてインパクトの大きい成果が期待される。
本プロジェクトはその領域にバイオ研究プラットフォームを構築して一分子レベルでの精密な操作を可能とすることを最終的な目的とし、その前段階としてそもそも世界でも類を見ない、ナノサイズの流路の作製、流体導入、計測といった基盤技術を岡田TLとの連携のもと確立することを目標とした。


細胞内分子の1分子検出・識別法の開発

概要

一分子イメージング技術を利用し、細胞由来の分子を一分子感度で検出および識別できる分析法を開発しています。我々が独自に開発したライトシート顕微鏡(PISA顕微鏡)を使用すれば、高速かつ3次元的な一分子イメージングが可能になり、一分子レベルでの遺伝子発現の解明や高感度の体液診断法の開発などに使用できます。このように汎用的、ハイスループット、高感度といった利点が高く評価され、2020年、PISA顕微鏡の光学系は、海外の大手光学機器会社により商品化されました(ZEISSLattice Lightsheet 7)。DECODEプロジェクトでは、既存の生化学分析法にPISA顕微鏡による3次元一分子イメージングと画像解析技術を融合し、一細胞研究や体液診断などに応用できる新規のバイオ分析法の創造を目指します。


ヒトiPS由来網膜組織のシングルセル解析

概要

2020年11月にヒトiPS細胞から分化誘導された神経網膜シートを用いた視細胞変性治療のための臨床研究が始まった。本研究で用いられた神経網膜シートは当施設で研究開発されたものであるが、現時点で移植用網膜シートはヒト幹細胞から分化した網膜オルガノイドから色素上皮部や毛様体部を除くよう神経網膜を切り出して作製している。切り出しには熟達した技術が必要となるだけでなく、切り出せるサイズは約1mm×1mm未満と小さく、広範囲の病変をカバーするには多くの神経網膜シートが必要となり莫大な費用と労力を要する。解決策として大型の神経網膜シートの開発が挙げられるが、空間的・時間的にヘテロジニアスな細胞集団からなる網膜オルガノイドの分化誘導を適切に制御し、品質と安全性を担保した大型の網膜オルガノイドを作製する技術は確立されていない。そこで本プロジェクトでは、特定の分化段階にある網膜前駆細胞のみから網膜シートを再構築することで、視細胞以外への分化を抑制した大型の次世代型移植用網膜シートの開発を目指す。そしてそのために必要な網膜前駆細胞の細胞特性を理解するためにscRNA-seqを行う。


新規組織幹細胞とそのニッチの探索

概要

成体組織の恒常性は組織幹細胞によって支えられている。特に組織幹細胞の自己複製能と多分化能が組織の新陳代謝や損傷再生の要である。呼吸器は常に外気を取り込むことで生理機能を果たすため、外環境から侵入する細菌、ウィルス、有害物質により組織損傷を受ける可能性に晒されている。呼吸器上皮組織は、平常時は代謝は比較的ゆっくりだが、傷害を受けると急速に細胞増殖し、障害部位を修復する。このような幹細胞が障害に応答して再生能を賦活化する様式の組織再生は獲得性組織再生(facultative regeneration)と呼ばれ、組織幹細胞の潜在的な自己増殖能、多分化能のダイナミックな変化が特徴となる。多様な障害に対応するため、呼吸器の特に上皮組織には多種の組織幹細胞が存在することが知られている。
最近の幹細胞培養技術の革新により、成体の組織幹細胞を研究室内で長期培養し、オルガノイドと呼ばれるミニ臓器を再構成することが可能になった。肺オルガノイド培養は、肺の組織幹細胞を単離し、3次元足場上で培養することでスフェア状に成長させる培養系であり、肺の幹細胞動態研究に適している。本研究計画では城口研究室とともに行う肺の組織幹細胞とオルガノイドの画像解析とscRNA-seq解析を組み合わせ、新規幹細胞の探索を行う。選ばれた新規マーカー候補はマウス肺を使ってその性質を検証する。特に新陳代謝や損傷再生時における細胞動態からin vivoでの幹細胞性を検証する。


神経オルガノイド誘導過程における神経上皮形成のDECODE

概要

神経オルガノイドは多能性幹細胞由来の三次元神経組織である。オルガノイドの分化誘導過程においては自己組織化的に神経上皮が形成されるが、どのように上皮構造が形成されるのかはわかっていない。本課題では、神経上皮を蛍光識別できるノックインヒト多能性幹細胞を用いて神経オルガノイドを誘導し、その分化過程を4Dイメージングで観察することで立体組織における上皮構造がどのように形成されるのかを捉える。上皮が形成されるキーポイントにおいて遺伝子バックグラウンドを明らかにすることで、複雑な組織が形成されるメカニズムを明らかにする。